Research Progress on Pectin Methesterase Response to Disease Resistance and Aluminum Tolerance

Jia Yujiao  Pei Yakun  Zhu Yutao  Hu Xiaoqian  Hou Yuxia ^*

The State Key Laboratory of Cotton Biology, College of Science, China Agricultural University, Beijing, 100193

* Corresponding author, yuxiacau@163.com

Abstract  Pectin methylesterase (PME), a cell wall protein, is the key enzyme in pectin metabolism and mainly catalyzes the demethylation of pectin. In the process of cell development, PME modified pectin makes the highly methylated pectin in plant cell wall demethyl, thus giving different functions to cell wall. Pectin methylesterase is closely related to plant stress resistance, growth and development mechanism, and aluminum stress affecting plant growth. With the improvement of people's living standards, it has become a research hotspot to study plants from the molecular level and ensure food safety. In this paper, two structural models and three action models that respond to plant disease, insect resistance and aluminum stress of pectin methylesterase were reviewed.

Keyword  Pectin methylesterase, Resistance, Aluminum stress, Growth regulation

果胶甲酯酶(Pectin methylesterase)存在植物细胞壁中，作为抗逆和调控植物生长因子被广泛研究。如拟南芥(Arabidopsis thaliana) PME不仅可以发挥抗倒伏的功能，还能促进花粉的形成和花粉管的生长(Pina et al., 2005)；毛白杨(Populus tomentosa Carr.)的PME35通过调节气孔开合，可以对干旱胁迫做出应答(Yang et al., 2020)；黄柏的PME与其种子发芽密切相关；朝天椒(Capsicum frutescens)的PME可以促进辣椒的成熟与软化(Arancibia et al., 2020)。近年来，随着PME在植物生长发育、果实成熟软化以及抗胁迫等方面的研究逐渐完善，PME在植物抗病方面的影响也渐渐被重视起来。探究PME的结构及作用机制，有助于提高PME的表达，保证植物的健康生长。本研究以现有的研究现状为依据，综述了植物PME的结构、作用模式及抗胁迫功能的研究成果，以期为研究PME在植物抗病方面的功能提供参考。

1植物PME的两种结构模型

果胶是一组结构复杂的多糖，是细胞壁的主要组成成分，通常以高度甲酯化的形式存在。PME是果胶代谢过程中的关键酶，PME通过催化果胶的去甲基影响细胞壁的组成，对细胞生长中有着重要作用。PME都具有保守的PME结构域(Sénéchal et al., 2015)，根据PME结构可将其分为两种类型。以棉花(Gossypium hirsutum) PME结构为例，其催化结构域N端含有PRO区(PRO结构域与Pectin methylesterase inhibitor结构域相似，在分泌过程中被认为从蛋白质成熟的催化部分上裂解下来，并且介导PME在高尔基体的滞留以及转录后可影响PME的酶促活性)的PME被定义为I型，大概含有250~400个氨基酸残基，分子量为27~45 kD；而缺乏PRO区的PME则是II型酶，含有500~900个氨基酸，分子量为52~105 kD (Tian et al., 2006; Liu et al., 2018)。以I型酶棉花PME2 (GhPME2)和II型酶棉花PME31 (GhPME31)为例(图1A)，最先获得的是细菌的PME三维结构，随后在胡萝卜的根部纯化得到大量成熟的PME，继而首次得到了植物的PME三维立体结构，并找到蛋白表面的裂缝构成活性中心(Markovic et al., 2005)。植物的PME活性位点空腔相对较浅，没有明显的立体屏障，而菊欧文氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)的活性位点空腔则比较深(Jenkins et al., 2001)，它们的活性部位含有羧酸水解酶(Johansson et al., 2002)。由于棉花PME既不含a/b水解酶折叠物，也不含催化三联体，因此被认为是一种新型水解酶。此外在细胞壁观察到的成熟的PME是不具有PRO区域的，说明成熟PME的PRO区域是要从PME上裂解掉的(Liu et al., 2018)。

图 1 I型和II型果胶甲酯酶保守结构域(A)及植物果胶甲酯酶三维结构的同源模型(B) 注: I型的PRO区域用灰色表示; 信号肽用条带模式显示; PME催化结构域部分用黑色显示; AA代表氨基酸(Liu et al., 2018); 红色: 具有α螺旋的回折; 黄色: 平行的β折叠卷曲; 白色: 酪氨酸残基; 浅绿色: 色氨酸残基; 蓝色: 苯基丙氨酸残基(Micheli, 2001) Figure 1 The conserved domains of type-I and type-II pectin methylesterases (A) and Homology model of the three-dimensional structure of a plant pectin methylesterase (B) Note: The PRO region of GhPME2 is designated in gray; The signal peptide is designated by a striped pattern; The PME catalytic domain is designated in black; AA: Amino acid (Liu et al., 2018); Red: Reflexes with an alpha helix; Yellow: Parallel β sheets; White: Tyrosine residue; Light green: Tryptophan residue; Blue: Phenylalanine residue (Michel, 2001)

在前人的研究中已经阐明了菊欧文氏杆菌、西红柿、胡萝卜以及棉花的PME三维结构(Jenkins et al., 2001; Johansson et al., 2002; Ciardiello et al., 2008)。这些酶在结构上具有很高的相似性，都有3个内含疏水结构的b折叠的螺旋结构，它们的结构差异主要表现在半胱氨酸(Cys)残基、组氨酸(His)残基和芳香族氨基酸残基上。

2 PME的三种作用模式

PME在细菌、真菌和植物中是普遍存在的，不同的PME结构具有较高的相似性，但在性质及作用模式上会有很大差别。就植物与其他果胶食品而言，果胶甲酯化的程度和模式被认为决定了果胶在植物细胞壁和含果胶食品中的功能特性,PME从果胶链上催化去除甲酯，不仅影响其重塑其精细结构，并且也对其随后的(非)酶转化反应(如果胶解聚)和凝胶形成的敏感性产生影响(Jolie et al., 2010)。

PME的作用模式大致分为三种：(1)多个PME同时结合到果胶的作用位点上，去催化连续排列的果胶去甲酯化反应—单链去甲基途径；(2)每条果胶链每次只和一个PME结合只催化一个甲酯键，催化结束后从底物上游离—多链途径；(3)单一的PME结合到一条果胶链上，游离底物前催化一定数量的去甲酯化反应—多重反应途径(Pelloux et al., 2007; 熊兴鹏, 2019)。作用模式决定了去甲基化反应的最终产物，这些最终产物可以抑制PME的活性，成为了可以影响PME活性物质的一部分。

成熟的PME的作用模式可以受到多种因素的调节，这些因素不仅解释了酶的复杂性，而且还提出酸碱性对于随机去甲基化和线性去甲基化(PME沿着果胶链随机地或者线性地进行去甲酯化反应)的关系。在植物抗病方面的研究中，可以通过影响PME活性的这些因素，对PME进行正向或者负调控，以得到研究结果，所以PME对于植物生物学家和食品技术人员都是十分重要的。

3果胶甲酯酶应答病虫抗性

3.1果胶甲酯酶应答病原菌侵染

据报道，有很多物质可以抑制PME活性，包括去甲基化反应的最终产物、单宁、甘油以及果胶甲酯酶抑制剂(Pectin methylesterase inhibitor)等。Pectin methylesterase inhibitor(PMEI)最初是在猕猴桃果实中发现的，后来在拟南芥、西红柿、辣椒、棉花等植物中也有发现(Raiola et al., 2004; An et al., 2008; Reca et al., 2012)。PMEI首次被证明控制内源PME活性的有效性是通过超表达拟南芥AtPMEI-1和AtPMEI-2实现的，在转基因拟南芥中，由灰霉菌(Botrytis cinerea)和果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)引起的病害症状显著减轻(Lionetti et al., 2007)。

PMEI属于一个大的由多基因编码的蛋白质家族，其中还包括转化酶抑制剂(invertase inhibitor, Inh)。PMEI的结构主要是含有四个参与二硫键形成的保守的Cys残基，还有与Inh相似的上下四螺旋束(Di Matteo et al., 2005; Lionetti et al., 2014; Lionetti et al., 2015)。植物中PMEI通常与PME按1：1化学计量比形成特异复合物，抑制PME活性(Hothorn et al., 2010)。在形成复合物之前，PMEI与PME上的表面电势不同，以棉花的PME31、PME2和PMEI3基因为例，GhPME31和GhPME2与GhPMEI3结合形成复合物后，复合物表面电势与单个蛋白质的表面电势也均不相同(Liu et al., 2018) (图2)。

图 2 GhPMEI3 (A), GhPME2 (B), GhPME31 (C) GhPMEI3-GhPME2复合物(D)和GhPMEI3-GhPME31复合物(E)的表面电势 注: 表面电位用红色(-5)或蓝色(+5)表示; A到C标记的单个蛋白质区域具有明显不同的表面电势(Liu et al., 2018) Figure 2 Electrostatic surface potential of GhPMEI3 (A), GhPME2 (B), GhPME31 (C), GhPMEI3-GhPME2 complex (D), and GhPMEI3-GhPME31 complex (E) Note: The surface potential is designated in red (-5) or blue (+5); The regions of individual proteins marked in A to C possess distinctly different surface electrostatic potentials (Liu et al., 2018)

对100多种植物PME的氨基酸序列进行了比较，结果表明，所有的PME均含有5个序列相似性很高的片段，以此来代表PME的“特征模式”，包括6个严格保守的残基：3个甘氨酸(Gly)残基、1个天冬氨酸(Asp)残基、1个精氨酸(Arg)残基和1个色氨酸(Trp)残基,还有几种高度保守和功能重要的芳香族残基(Jolie et al., 2010)。关于二硫键不同的植物各不相同，像胡萝卜的PME组成中就不含有二硫键桥，2003年曾有研究者报道过番茄的PME中含有两个链内二硫键桥，但在2015年被驳回了。PMEI与PME结合时，PMEI覆盖配体所在的酶的大部分结合活性位点，PMEI的α-螺旋在位置上垂直于PME的β-螺旋。

PMEI与PME的复合物的三维结构显示PMEI覆盖了PME与底物结合的作用位点，使果胶无法与PME结合，从而达到抑制果胶去甲酯化的反应(Hothorn et al., 2010)。PMEI的抑制作用的强弱受所处微环境pH的影响很大(Bonavita et al., 2016)，如随着pH的增大，西红柿PME和猕猴桃PMEI之间的相互作用迅速减弱，在pH值为8.0时观察不到任何复合物(Hothorn et al., 2010)。

已经证明棉花PMEI3通过抑制棉花PME2和PME31的活性，调节了果胶去甲酯化(Liu et al., 2018)。由于真菌病原菌不能利用甲酯化的果胶，从而增强了植物对病原菌的抗性。棉花PMEI对棉花PME活性的抑制可以解释为PME酶的活性如何在细胞壁内协调的，通过这种协调达到了抵抗部分病原菌侵染的目的。

3.2果胶甲酯酶应答蚜虫定居和取食行为

蚜虫吸吮植株韧皮部汁液可以作为植物病原病毒的载体，对世界范围内的作物产量构成严重威胁。果胶被认为是植物在感染植物病原菌时的防御因子。比如绿桃蚜侵染拟南芥的过程中，它的唾液中存在果胶修饰酶，如PME和PG等，便于其口针穿透细胞间基质(Silva-Sanzana et al., 2019)。据报道，在桃蚜摄食过程中，AtPMEI13基因表达量会出现明显上调(De et al., 2007)，继而就有研究者对桃蚜摄食拟南芥，对于拟南芥PME基因表达量的影响进一步研究。将桃蚜初接触拟南芥叶片至相互作用6 h成为侵染初期，取侵染初期叶片进行PME总活性鉴定，发现被侵染叶片果胶去甲基化信号明显增大，说明在桃蚜摄取拟南芥初期，拟南芥的PME总活性是增强的，并且还发现甲醇的排放量增大了三倍(Silva-Sanzana et al., 2019)。

外源抑制剂抑制植物PME活性，可以降低桃蚜摄食拟南芥，利用外源PME增强，会提高桃蚜摄食的可能性。外源和内源调节PME活性可以对桃蚜取向摄餐具有一定影响。

4果胶甲酯酶与油菜素甾醇及耐铝胁迫的相关性

油菜素甾醇是继赤霉素、生长素、脱落酸、细胞分裂素、乙烯之后发现的第六大激素，主要在植物生长发育中发挥作用(Belkhadir and Jaillais, 2015; Jaillais et al., 2016)。油菜素甾醇的合成突变体有明显抑制植物根伸长生长的表型(Kim et al., 2006; Yan et al., 2018)。研究表明，在野生型拟南芥植株中使果胶甲酯酶基因过表达，不会引起根长度的改变，而在油菜素甾醇突变体拟南芥中过表达果胶甲酯酶基因，能够在一定水平恢复由油菜素甾醇合成缺失引起的根生长抑制的表型(张清凤, 2016)。

果胶甲酯酶除了可以应答植物激素调控和病原菌侵染外，研究表明还与铝胁迫应答有关。生物和非生物胁迫都严重影响植物的发育(Yang et al., 2020),一般植物根系是与铝离子直接接触的部位，因此植物的根系根尖也是受铝毒危害最严重的的部位(https://kns.cnki.net/KCMS/detail/46.1019.s.20200526.1727.002.html)。玉米根尖2~3 mm用一定浓度的铝溶液进行胁迫处理，引起玉米根生长的抑制。但根部其他部位在铝毒的作用下对根产生的影响远小于根尖。据报道，根尖在铝毒作用下对植物产生的损伤远超过其他部位所形成的。植物根尖是铝毒对根生长抑制的作用耙位。用铝胁迫处理玉米敏感品种30 min，出现根伸长抑制现象，并且根的伸长抑制较耐感品种更为明显。在对小麦耐性和敏感品种铝胁迫的研究中有同样的发现，在用铝处理两个品种根部6 h后，两个品种的根的伸长均受到了抑制，敏感品种根伸长被抑制的更为明显。测定两个品种经铝处理后PME活性变化，发现铝处理后小麦根尖(0~10 mm)部分的PME的活性受到影响，其他部分变化两个品种差异不大(唐剑锋等, 2006)^[37]。

铝胁迫下，PME的表达会上调，这是因为被分泌到细胞外是甲酯化程度很高的果胶，PME可以使果胶去甲基化后成为含有大量游离羧基的果胶酸，铝离子可以和这些果胶酸结合，从而果胶变硬，参加细胞壁的构建。但铝离子与果胶酸的结合受很多因素的影响，PME活性、溶液pH、溶液中其他离子的浓度等(Micheli, 2001)。根据相关研究，植物根尖PME的活性与果胶甲基化的程度呈负相关，同时与铝的积累量呈正相关。因此，PME活性直接影响植物受铝毒害的程度(Yang et al., 2013)。

但是，关于果胶甲酯酶与油菜素甾醇的如何共同调节植物生长机制的研究还鲜有报道，PME在花粉的形成及花粉管的发育中发挥着极大地作用，在特殊条件下通过有效的提高PME的表达一方面会使植株健康生长，另一方面或许与植物的抗病特性密切相关。果胶在PME的作用下生成果胶酸，果胶酸与铝离子结合形成果胶酸铝。果胶酸铝具有交联能力，可以使植物细胞壁变硬，细胞壁的变硬可以加强细胞与细胞之间的粘附，也使细胞更不易被多聚半乳糖醛酸酶水解，进而改变细胞壁的生物学特性与功能，使细胞壁-质膜-细胞骨架结构改变，细胞伸长纵向受到抑制，横向增长得到促进，最终表现为植物根部伸长受到抑制。细胞壁的变硬可以增强植物细胞抵抗外来病原菌侵染的能力，从而达到抗病的目的。

5展望

PME是在细菌、真菌和植物中普遍存在的一类酶，在植物生长发育方面主要对细胞壁、恶劣环境中根的发育影响较大，由于PME与植物细胞壁联系紧密，细胞壁作为细胞抵抗病原菌侵染的第一道屏障对于植物的抗病性来说至关重要，并且在研究抗病过程中去探索PME与信号转导通路的关系，对于调节植物生长发育也有着重要意义。随着越来越多果胶甲酯酶被研究，植物果胶甲酯酶的研究也趋于成熟，尤其是其结构、作用模式、理化性质等，但仍有不少疑问亟待解决：(1)许多植物的PME基因功能尚未被挖掘出来，它们对与植物抗病方面的影响还有待进一步探究；(2) PME基因在植物抗病过程中与信号转导通路的关系；(3)如何通过基因手段提高PME的表达量也需待解决。PME的功能繁多，促进植物生长发育，促使植物更加茁壮，利用它们开发出更有价值的经济产品具有重大意义。

作者贡献

贾玉姣是综述的主要撰写人，完成相关文献资料的收集和分析及论文初稿的写作；裴雅琨、朱玉涛、胡晓倩参与文献资料的分析、整理；侯玉霞是项目的构思者及负责人，指导论文写作。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家重点研发计划项目“化肥农药减量增效综合技术研究与开发”(2017YFD0201900)资助。

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